Il progetto capolavoro di Leon Battista Alberti venne realizzato da Luca Fancelli, architetto principe del '400 mantovano, che la completò nel 1494 senza scostarsi dalla grande idea albertiana. La cupola (1733-1765), alta 80 metri, è di Filippo Juvarra. Nel ricchissimo arredo pittorico, le firme di Andrea Mantegna, del suo allievo Antonio Allegri detto il Correggio, di Giulio Romano e dei suoi allievi, di Domenico Fetti, Francesco Borgani, Giorgio Anselmi, Rinaldo Mantovano, Felice Campi e Andreasino.
La prima cappella a sinistra custodisce la tomba di Andrea Mantegna, decorata dal Correggio sulla base di disegni mantegneschi. Di Mantegna si possono ammirare il Battesimo di Cristo sulla parete di destra, completato dal figlio Francesco, e la Sacra Famiglia e famiglia del Battista, sull'altare.
Da ammirare inoltre la grande pala d'altare - Madonna col Bambino in trono tra i santi Sebastiano, Silvestro, Agostino, Paolo, Elisabetta, Giovannino e Rocco - di Lorenzo Costa il Vecchio e gli affreschi della cappella di San Longino su disegno di Giulio Romano.
All'interno della cripta, disegnata alla fine del '500 da Anton Maria Viani, è custodita un'arca contenente i Sacri Vasi, preziose ampolle contenenti quello che si ritiene il Sangue di Cristo, raccolto insieme alla terra del Golgota dal legionario Longino. Ogni anno, in occasione del Venerdi Santo, le ampolle vengono esposte e portate in processione per le vie del centro storico.